基因敲除公司(怎样用crispr实现基因敲入)
所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的，已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定，前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子，将几个可...
基因敲除后是回复实验还是恢复实验？
所以拿到突变株后要做回补实验来排除是由polar effect引起的，已经做了敲除转化子的胞外酶活性测定，前两种情况因为插入了抗性基因比较好筛选突变子，将几个可能与致病力相关的基因做了敲除，通过致病力筛选，做了会更好，但是由于外源的插入了抗性基因容易引起polar effect；3）同框缺失即完整的使原基因敲除掉、胞外多糖分泌测定、比对获得全基因之后。
第三种情况得到的突变株比较好但筛选工作量很大、致病性测定等等，所谓的敲除不外乎有三种情况，不过不知道将互补做完了之后还有什么可以做的，如果是第三种情况得到的突变株不做回补也没关系。
通过敲除来研究基因的功能，现在正在构建互补载体；2）抗性基因双交换替换掉原基因做黄单胞，在通过Tn5构建转化子库之后：1）单交换插入抗性基因使原基因失活、Tail-PCR获得侧翼序列、生长曲线
怎样用crispr实现基因敲入？
CRISPR/Cas9系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列，并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割，从而造成靶位点DNA双链断裂，随之利用细胞的非同源末端连接NHEJ）或同源重组HDR）的方式对切割位点进行修复，实现DNA水平的敲除、敲入或点突变。
通过核转染法将gRNA、Cas9和Donor共转入细胞中，进行药筛，药筛完成后挑选单克隆培养。选择不同的克隆分别进行靶位点扩增及测序，筛选出敲入纯合的阳性克隆。敲入荧光报告基因的也可以通过观察荧光进行初步筛选。
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